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检验技师考点:软琼脂培养法克隆
(1)软琼脂的配制:含有20%NCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640.
①1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。
②0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
(2)用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。
(3)按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
(4)1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
(5)混匀后立倾注于琼脂基底层上,在室温中10min,使其凝固,孵育于37℃、5%CO2孵箱中。
(6)4~5天 后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。
(7)检测抗体,扩大培养,必要是地再克隆化。
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